超高速离心机的几种分离方法

A.差速离心：逐次增加离心力，每次可沉降样品溶液中的一些组份。 
　　差速离心是一种常用的方法。在这种方法中，离心管在开始时装满了均一的样品溶液。通过在速度下时间的离心后，就可得到两个部份：沉淀和上清液。 
　　通常在次离心时把大部分不需要的大粒子沉降去掉。这时所需的组份大部分仍留在上清液中。然后将收集到的上清液以更高速度离心，把所需的粒子沉积下来。离心的时间要选择得当，使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。对于得到的沉淀和上清液可以进行进一步的离心，直到达到所需要的分离纯度为止。 
　　差速离心的特点是操作简单，但分离纯度不高。 
B.密度梯度离心法：可以同时使样品中几个或全部组份分离，具有很好的分辨率。 
1)速率区带法(rate zonal)： 
　　根据样品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)。大致步骤如下： 
　　在离心管中装入密度梯度溶液，溶液的密度从离心管顶部至底部逐渐增加(正梯度)。 
　　将所需分离的样品小心地加至密度梯度溶液的顶部。样品在梯度溶液表面形成一负梯度。 
　　由于不同大小的粒子在离心力作用下，在梯度中移动的速度不一样，所以经过离心后会形成几条分开的样品区带。 
　　注意：样品粒子的密度大于梯度液注中任一点的密度。离心过程在区带到达管子底部前停止。 
2)等密度离心法(isopycnic)： 
　　根据粒子的不同密度来分离。离心过程中，粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带。 
　　密度样度的选择要使梯度的范围包括所有待分离粒子的密度。样品可以在密度梯度液粒上面或均匀分布在密度梯度中。经离心后，样品粒子达到它们的平衡点。注意：平衡后粒子的分离由其密度决定，与时间无关，此时再改变离心转速，只能改变区带的相对位置。 2.密度梯度分析法 
1)梯度介质性质与选择： 
A、应具备的性质 ： 
　　梯度物质的选择原则是满足分离方法的基本要求，一个理想的密度材料标准它应是： 
　　· 所形成的溶液密度应包括所需要的密度范围。 
　　· 具有某些性质，如折射率，据此可测定它的浓度。 
　　· 所形成的溶液粘度低。 
　　· 不损伤所分离的样品。 
　　· 离心分离后容易除去。 
　　· 不妨碍分离积分的分析。 
B、常用介质种类： 
　　表一、常用梯度材料在20℃密度 
B.梯度介质应用范围： 
　　表二、等密度梯度介质的应用 
　　+++很好 ++好 +可以 --不适用 
　　表三、各种大分子在蔗糖梯度液中的大约密度 
(2)、梯度溶液的准备： 
　　计算 
　　稀释(本文第三章部分) 
(3)、梯度形状 
　　梯度形状分：线型、等速型、阶梯型、平坦型、陡峭型指数梯度。(如下图) 
　　梯度形状对于分离是否成功重要： 
　　常用的是线型梯度，适用于分离蛋白质、酶、激素、核糖体亚基和一些植物病毒;等速型适用于分离脂蛋白和一些需上浮分离样品;不连续或阶梯型梯度适用于分离整细胞、亚细胞组分以及纯化一些哺乳类动物病毒或昆虫病毒。等速梯度以及长液柱可增进分离能力，适用于分离核糖体亚基、多核糖体及植物病毒。 
B.梯度柱制备： 
　　梯度液柱可以用手工或梯度仪制备 
　　半注法： 
　　为缩减离心时间，或分离样品较少可用半注法：下半管铺置梯度介质，中间加样品，上面铺Buffer或液体石腊油。 
(4)、加样方法与加样量： 
　　将样品加到梯度液柱上，针尖和离心管成45-60°角度，慢慢地将样品沿管壁流到液面上去，对于DNA一类易断的脆弱样品，应该用孔径较大的移液管代替针头，以避免剪切力对样品的切割作用。样品浓度是梯度柱小密度的1/10(W/W)。 
(5)、转子的选择与效应： 
(6)、分离区带的回收及检测 
　　离心后所形成的区带样品的回收方法基本有四种： 
a.穿刺法 
　　穿刺离心管底部，使梯度溶液滴出，将一具有合适阀门的盖帽放在离心管顶，可控制滴出速度。 
b.虹吸法： 
　　将一毛细管轻轻插入管底，尽量防止梯度抖动，用微量泵逐渐滴取，以量滴数或体积部分收取。 
c.加压法： 
　　通过一针管将高密度的液体泵入到梯度离心管的底部，部分收集换出的溶液。 
d.切割法： 
　　采用专用的切割刀切割所需区带。